Siyah hardal tohumundan ( Brassica nigra) lipaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Lipazlar yapıları incelendiğinde yağ asitlerinden ve gliserolden oluşturulan esterlerin su ile etkileşimi sonucunda ikiye ayrılan veya lipit yapılarında bulunan ester bağlarının oluşumunda katalizör görevini üstlenen enzimler olarak bilinirler. Çalışma ile lipaz saflaştırılan bitkisel kaynaklara bir alternatif oluşturulmuş ve ilk defa hardal tohumundan lipaz enziminin eldesi gerçekleşmiştir. Hardal tohumundan lipaz eldesi konusunda hardal tohumunun yapısında bulunan proteinlerin yağsızlaştırılması ile başlanmıştır. Jel filtrasyon kromotografisi prosesleri kullanılarak hardal tohumu lipazı saflaştırılmıştır. Bütün saflaştırma yöntemlerinde Bradford metoduna göre protein tayini yapılmış ve titrasyon işlemleri ile lipaz aktivitesi tayini gerçekleştirilmiştir. Buna bağlı olarak spesifik aktivitelerin hesaplanması yapılmıştır. İşlemler sonucunda hardal tohumu lipazının 37,89 kat saflaştırıldığı tespit edilmiştir. Saflaştırılan lipaz enzimi SDS-PAGE ile karakterizasyonu yapılmıştır. Enzim en yüksek aktiviteyi pH 5,6 ve 60 derecede göstermiş, ayrıca stabil pH ve stabil sıcaklık seviyeleri de 6,8 ve 4 ˚C olarak tespit edilmiştir. Lipaz enziminin depolanma kararlılığını belirlemek amacıyla iki hafta boyunca stabil şartlarda +4 ˚C derecede aktivitesini koruduğu tespit edilmiştir. Lipaz enzimleri için önemli parametrelerden olan Km ve Vmax değerleri hesaplanmış, substrat olarak da triolein kullanılmıştır. Km değeri 0,1222 mM ve Vmax değeri ise yaklaşık 1,0195 U/dk.mg enzim olarak bulunmuştur.

When lipases are investigated, they are known as enzymes which act as catalysts in the formation of ester bonds, which are separated into fatty acids and glycerol-derived esters as a result of interaction with water or lipid structures. In this study, it is aimed that the mustard seed is an oily seed and that the obtained lipase is obtained pure and characterized. An alternative to lipase-purified plant sources was established by the study and the first time the enzyme of the lipase enzyme from mustard seed was realized. The lipase enzyme purified from mustard seeds is initiated by de-oiling the proteins found in mustard seeds. The mustard seed lipase was purified using gel filtration chromatography. In all purification steps protein quantity was measured according to Bradford method and lipase activity was measured by titrimetric method. Specific activity was calculated and it was determined that lipase was purified 37.89 fold. Maximum acitivity of cotton seed lipase was observed at pH 5.6 and 60 ˚C. It was found that stabil pH and stabil temperature 6.8 and 4 ˚C, respectively. To determine storage stability of purified lipase, activities were measured for two weeks. After two weeks lipases in 4 ˚C were protect their catalytic activity. To calculate Km and Vmax of mustard seed lipase, triolein was used substrate and Km value was calculated as 0,1222 mM, Vmax value was calculated as 1.0195 U/dk.mg.